Заочные электронные конференции
 
     
МОНИТОРИНГ ИЗМЕНЕНИЙ ИММУНОЛОГИЧЕСКОГО ГОМЕОСТАЗА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МЕТОДА СВОБОДНОГО РАСПРЕДЕЛИТЕЛЬНОГО КЛЕТОЧНОГО ЭЛЕКТРОФОРЕЗА ЛИМФОЦИТОВ КРОВИ
Вихрев Д.В.


Для чтения PDF необходима программа Adobe Reader
GET ADOBE READER

ВИХРЕВ ДЕНИС ВЛАДИМИРОВИЧ

МОНИТОРИНГ ИЗМЕНЕНИЙ ИММУНОЛОГИЧЕСКОГО ГОМЕОСТАЗА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МЕТОДА СВОБОДНОГО РАСПРЕДЕЛИТЕЛЬНОГО КЛЕТОЧНОГО ЭЛЕКТРОФОРЕЗА ЛИМФОЦИТОВ КРОВИ

Актуальность проблемы.

Несмотря на революционные успехи в развитии лабораторной иммунодиагностики, ее возможности при вторичных иммунодефицитах остаются крайне ограниченными (Хаитов Р.М., Пинегин .В., 2001). Это связано с выраженной многокомпонентностью иммунной системы, что затрудняет точную идентификацию пораженного звена иммунитета, а также с отсутствием полного знания о всех составляющих компонентах иммунной системы и особенностей их функционирования. При назначении лабораторных исследований перед врачом закономерно встает задача подбора минимально достаточного и информативного набора тестов для мониторинга состояния иммунологического гомеостаза у пациента. Предпочтительными в этих случаях являются интегральые показатели иммунобиологической перестройки организма, отражающие (желательно в достаточной степени дифференцировано) максимальное количество иммунологических характеристик максимально большего числа популяций и субпопуляций иммунокомпетентных клеток. Реализация такого подхода в настоящее время становится возможной при использовании современных инструменальных методов. К числу таких методов можно отнести свободный распределительный клеточный электрофорез лимфоцитов крови.

Использование метода клеточного электрофореза в иммунологии основано на способности клеток изменять величину поверхностного заряда при их активации антигенами, пролиферации и дифференцировке в процессе иммуногенеза.

Метод препаративного клеточного электрофореза в свободном потоке позволяет составить представление о доле клеток в популяции, вовлекаемых в процесс активации (Suga M., 1980, Eggleton P. et all., 1992).

Наблюдается зависимость между продукцией ряда ключевых иммуномедиаторов и электрокинетическими свойствами лимфоцитов (Фирстова В.В., 1996).

Колебания зарядов у разных, но здоровых индивидуумов очень незначительны. Последнее приобретает большое значение для дифференцировки многих патологических состояний. При патологии электрический заряд может существенно меняться как в результате изменения физико-химической структуры клеточной поверхности, так и вследствие нарушения состава окружающей среды - появление в средt антител, патологических белков, продуктов распада клеток и т.д. (Хараморенко С.С.,1974; Борзова Л.В. и соавт.,1975;Темнов А.В. и соавт., 1982;Мирошников А.И.,1986; Тихомирова Е.И., 1990;Kotzsch M. et all.,1982; Silva Filho. et all., 1987; Golovanov M.V., 1991; Walter H. et all., 1995; Kapur R., 1996).

Поэтому изучение величины электрического заряда клеток приобретает важное значение для мониторинга изменений гомеостаза, в том числе иммунологического (Хараморенко С.С., 1974; Козинец Г.И. и соавт., 1975; Тихомирова Л.А., 1985; Петров Р.В., 1987; Тихомирова Е.И., 1990).

Из работ многих исследователей следует, что значительные изменения электрокинетической подвижности иммунокомпетентных клеток наблюдаются в динамике инфекционного и вакцинного процессов, при аутоиммунных и онкологических заболеваниях (Ермакова Г.В. и соавт., 1982; Щуковская Т.Н., 1984; Ледванов М.Ю., 1987; Тихомирова Л.А., Тихомирова Е.И., 1990; Фирстова В.В. и соавт., 1996; Koenig U.D., 1985; Kraskina N. et all., 1985). Метод определения ЭФП лимфоцитов в настоящее время с успехом используется для интегральной оценки клеточного звена иммунитета у человека (при чуме, туберкулезе, злокачественных опухолях, миастении и т.д.) и экспериментальных животных (аллергический энцефаломиелит, оценка степени инбридинга и т.д.). Показана динамика нормализации электрокинетических свойств лимфоцитов перифереческой крови в динамике восстановления иммунологического гомеостаза организма при патогенетически адекватной терапии различных заболеваний (Герасимова К.И., 1990; Родионова Т.И., 1998; Мелещенко Н.Ю., 1999). Тем не менее, комплексных сравнительных исследований изменений электрокинетических свойств лимфоцитов крови при различных нозологических формах заболеваний не проводилось. Остаются неразработанными критерии оценки изменений электрокинетических свойств лимфоцитов крови в процессе иммуномодулирующией терапии.

Цель работы

На примере широкого спектра заболеваний изучить эффективность использования метода свободного распределительного клеточного электрофореза лимфоцитов крови для мониторинга изменений иммунологического гомеостаза, а также в качестве оценочного критерия иммуномодулирующей терапии.

Задачи исследования

  1. Провести анализ электрокинетических характеристик популяций и субпопуляций лимфоцитов крови у здоровых доноров (в том числе здоровых беременных женщин)

  2. Провести сравнительный анализ электрокинетических свойств лимфоцитов крови людей с инфекционной патологией (сальмонеллез, урогенитальный хламидиоз, генитальный кандидоз)

  3. Провести анализ электрокинетических характеристик лимфоцитов крови людей при аутоиммунной патологии (аутоиммунной офтальмопатии у больных диффузным токсическим зобом)

  4. Изучить электрокинетические характеристики лимфоцитов крови людей при хронических интоксикациях (опийной и алкогольной)

  5. Провести анализ электрокинетических свойств лимфоцитов крови при онкологической патологии (рак прямой кишки)

  6. Провести изучение динамики изменений электрокинетических свойств лимфоцитов крови в процессе иммуномодулирующей терапии

  7. Определить возможность использования показателей электрофоретической подвижности лимфоцитов крови для оценки изменений иммунологического гомеостаза, а также для определения и прогнозирования эффективности иммуномодулирующей терапии.

Научная новизна работы

Научная новизна работы определяется тем, что в ней впервые комплексно проведен анализ электрокинетических характеристик лимфоцитов крови у людей с различными заболеваниями (инфекционная патология, аутоиммунная патология, хронические интоксикации, рак прямой кишки), отличающимися по ведущему патогенетическому механизму.

Сравнительный анализ гистограмм распределения лимфоцитов крови у здоровых и больных людей позволил впервые убедительно показать отчетливое различной степени выраженности снижение электрофоретической подвижности лимфоцитов в группе больных, а также достоверные (характерные для конкретного заболевания) изменения у больных профиля распределения лимфоцитов по ЭФП. Особенно выраженные изменения ЭФП касались фракций лимфоцитов с низкой электрофоретической подвижностью, состоящих в основном из Т-лимфоцитов. Представлены новые закономерности, отражающие значительные изменения электрокинетических свойств популяций и субпопуляций лимфоцитов. Выявлены характерные особенности изменений электрокинетических свойств лимфоцитов крови, присущие отдельным нозологическим формам заболеваний.

Новыми являются данные о клинико-лабораторной эффективности терапии хронического пиелонефрита индуктором эндогенного интерферона – циклофероном. Выявлена способность циклоферона обеспечивать восстановление иммунологического гомеостаза, выражающееся в нормализации электрокинетических свойств лимфоцитов. Впервые с использованием конкретных значений электрофоретических свойств лимфоцитов показана зависимость между исходным состоянием иммунной системы у больных пиелонефритом и эффективностью последующей терапии циклофероном.

Обоснована эффективность иммуномониторинга заболеваний, сопровождающихся нарушением иммунологического гомеостаза, с использованием клеточного электрофореза.

Практическая значимость

Определена практическая значимость и количественные критерии электрокинетических характеристик лимфоцитов крови для оценки изменений иммунологического гомеостаза.

Результаты исследований могут быть использованы в практическом плане для иммуномониторинга применения иммуномодулирующих препаратов, а также прогнозирования эффективности их действия.

Полученные данные могут быть полезны при разработке индивидуальных схем иммуномодулирующей терапии (реализации принципа индивидуализации иммуномодулирующей терапии). Результаты работы могут явиться основой создания эффективных систем иммунологического мониторинга развития иммунодефицитных состояний, а также для решения задач прогнозирования и контроля комплексной терапии.

Внедрения в практику

По материалам исследований составлены учебно-методические рекомендации “Электрокинетические свойства клеток и их использование в медицине”, которые рассмотрены и утверждены (протокол № 4 от 25 января 2002 г.) редакционно-издательской комиссией при медицинском факультете Пензенского государственного университета. Учебно-методические рекомендации используются в практической работе и научных исследованиях лабораторий РосНИПЧИ “Микроб” (г.Саратов). Материалы диссертации используются в учебном процессе на кафедрах биологии, физиологии и терапии медицинского факультета ПГУ, на кафедре гистологии Саратовского государственного медицинского университета.

Апробация работы

Материалы диссертации представлены и обсуждены на:

  • 4-ом конгрессе Российской Ассоциации Аллергологов и Клинических Иммунологов (РААКИ) “Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии”, Москва, 2001 г.

  • Пятой научной конференции с международным участием “Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2001”, Санкт-Петербург, 2001 г.

  • III Всероссийской конференции с международным участием “Гомеостаз и инфекционный процесс”, Сочи, 2002 г.

  • Международном конгрессе «Практикующий врач», Сочи, 2002 г.

  • Межкафедральной конференции Медицинского факультета ПГУ и СГМУ

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 9 научных работ

Проведенные исследования показали (Рис. 1), что у здоровых доноров (возрастная группа 23-33 лет) лимфоциты крови распределялись по электрофоретической подвижности (ЭФП) с 51 по 69 фракцию и формировали 4 хорошо выраженные, различающиеся по ЭФП популяции. Популяция, обладающая максимально выраженной ЭФП (А) составляла в среднем 28,345,94% от всего пула клеток. Максимальный выход клеток в данной популяции отмечался в 55 фракции (10,231,86%). Популяция с меньшей ЭФП (Б), распределявшаяся с 58 по 62 фракцию, включала 23,553,78% клеток с максимумом в 60 фракции (14,211,94%). Наибольший процент лимфоцитов крови составлял на гистограмме пик В (34,116,76%). В 63 фракции идентифицировался максимальный выход клеток (21,763,25%) при электрофоретической сортировке лимфоцитов крови доноров. Популяция лимфоцитов, обладающая наименьшей ЭФП, определялась в 65-69 фракциях (14,333,36%). Максимум значений выхода клеток составлял 8,211,05% (66 фракция).

Результаты типирования лимфоцитов (полученных с помощью распределительного клеточного электрофореза) с использованием моноклональных антител анти-СD3 (Т-лимфоциты) и анти-CD19 (В-лимфоциты) показали (рисунок 2), что клетки, относящиеся к В-популяции, концентрировались преимущественно в низкоподвижных в электрическом поле фракциях (59-69 фракции). Максимум выхода В-лимфоцитов отмечался при идентификации 63 и 66 фракций (5,781,76% и 5,281,71%). Т-лимфоциты распределялись с 51 по 66 фракцию. Наибольший процент Т-лимфоцитов определялся в 63 фракции (15,91 2,92%).

У здоровых детей (возрастная группа 3-10 лет) лимфоциты крови распределялись по электрофоретической подвижности (ЭФП) с 51 по 74 фракцию и формировали 4 хорошо выраженные, различающиеся по ЭФП популяции. Популяция, обладающая максимально выраженной ЭФП (А) составляла в среднем 16,213,814% от всего пула клеток. Максимальный выход клеток в данной популяции отмечался в 55 фракции (5,120,74%). Популяция с меньшей ЭФП (Б), распределявшаяся с 58 по 61 фракцию, включала 22,423,46% клеток с максимумом в 60 фракции (9,131,56%). Наибольший процент лимфоцитов крови составлял на гистограмме пик В (49,307,14%). В 63 фракции идентифицировался максимальный выход клеток (15,813,11%) при электрофоретической сортировке лимфоцитов крови детей. Популяция лимфоцитов, обладающая наименьшей ЭФП, определялась в 67-74 фракциях (12,312,18%). Максимум значений выхода клеток составлял 3,740,73% (69 фракция). Распределение лимфоцитов крови детей обследованной возрастной группы по электрофоретической подвижности достоверно отличалось от распределения этих клеток у взрослых.

Лимфоциты, выделенные из периферической крови беременных, распределялись по электрофоретической подвижности (ЭФП) с 61 по 72 фракцию (рисунок 3). Гистограмма распределения была представлена одним пиком с максимальным выходом клеток в 66 фракцию (22,334,16%). При сравнении распределения лимфоцитов, полученных из крови беременных и небеременных женщин, обращает внимание обнаруживаемое у беременных выраженное смещение гистограммы в сторону преобладания клеток с пониженной ЭФП. Пик максимального выхода клеток в коллектор фракций у беременных смещался на 3 канала вправо (с 63 до 66 фракций).

При инфекционной патологии наблюдались значительные изменения распределения лимфоцитов по электрофоретической подвижности.

Лимфоциты (Рис. 2) крови женщин с урогенитальным хламидиозом, обнаруживаемые после электрофоретической сортировки во фракциях 67-82 формировали три отчетливо идентифицируемые популяции (пики с максимум выхода в 68, 70 и 74 фракции). Важно отметить, что у больных лимфоциты обнаруживались в наиболее низкоподвижных фракциях, в которых у здоровых женщин клетки не выявлялись вовсе (70-82 фракции).

Анализ электрофоретической подвижности лимфоцитов крови беременных с кандидозным вульвовагинитом позволил выявить следующие сдвиги в изучаемом показателе. Лимфоциты, выделенные из периферической крови беременных с генитальным кандидозом, распределялись по электрофоретической подвижности с 63 по 74 фракцию (рисунок 3). Гистограмма распределения была представлена двумя пиками с максимальным выходом клеток в 67 фракцию (22,974,71%). При сравнении распределения лимфоцитов, полученных из крови беременных без грибковых поражений и с генитальным кандидозом, отмечается статистически достоверное (Р

Библиографическая ссылка

Вихрев Д.В. МОНИТОРИНГ ИЗМЕНЕНИЙ ИММУНОЛОГИЧЕСКОГО ГОМЕОСТАЗА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МЕТОДА СВОБОДНОГО РАСПРЕДЕЛИТЕЛЬНОГО КЛЕТОЧНОГО ЭЛЕКТРОФОРЕЗА ЛИМФОЦИТОВ КРОВИ // Медицинские науки.
URL: http://econf.rae.ru/article/4411 (дата обращения: 27.01.2022).



Сертификат Получить сертификат